测序技术与分析课件：老师要求与复习重点¶

对应材料：

课件/7-生物信息学A-测序技术与分析.pptx
回放/生物信息学（协和班）第6周星期5第6,7节_笔记.txt
回放/生物信息学（协和班）第7周星期5第6,7节_笔记.txt
回放/生物信息学（协和班）第13周星期5第6,7节_笔记.txt
回放/生物信息学（协和班）第16周星期4第8,9节_笔记.txt

一、总体要求¶

这份课件内容很多，但老师真正要求掌握的重点非常集中。
不是要求把所有平台原理和所有软件安装命令都背下来。
老师更强调：
测序基础术语要熟
常见平台各自大概特点要会区分
RNA-seq、WES、单细胞这几条主流程必须会
工具名和分析步骤要能对应
题目里一旦让你“论述分析流程”，要能写文字也能画流程图

二、与期末重点的关系¶

这一章与期末重点最高度重合，必须优先复习。
最后理论课和最后实验课反复点名的核心内容，几乎都集中在这一章：
RNA-seq 分析流程
WES 分析流程
WES 与 RNA-seq 的差异
Mark Duplicate 的作用
突变检测与注释流程
工具名和对应步骤
单细胞相关流程

三、必须背熟¶

这些内容要达到“老师随口一问，你能直接说出来”的程度。

1. 基础术语¶

read：测序得到的一条序列读段。
R1 / R2：双端测序得到的两端 reads。
FASTQ：原始测序数据常见格式，包含序列和质量值。
参考基因组：如 hg19、hg38。
BAM / SAM：比对结果文件。
read count：某个基因上被计到的 reads 数量。
duplicate reads：起止位置完全一致、可能来自扩增重复的 reads。

这些词是后面所有流程题的语言基础，必须熟。

2. 测序平台大框架¶

一代测序：Sanger
二代测序：NGS / Illumina
三代测序：PacBio、Nanopore

要背到的程度：

Sanger 准确率高，是验证突变的“金标准”
Illumina 是当前最常用主力平台
三代测序读长长，但各有自己的误差和成本特点

3. `RNA-seq` 标准分析流程¶

这是最关键、最可能出应用题和流程图题的内容之一。

至少要能顺下来：

样本取材
测序获得 FASTQ
拿到 R1 / R2
比对到参考基因组
得到 BAM / SAM
统计每个基因的 read count
构建表达矩阵
做差异表达分析
做 GO / KEGG
做可视化

工具最少要配对到这一步：

比对：BWA / Bowtie
计数：featureCounts / HTSeq
差异分析：DESeq2 / edgeR

4. `WES` 标准分析流程¶

这是和 RNA-seq 并列的期末核心。

至少要能顺下来：

tumor / normal 样本
测序得到 FASTQ
比对到参考基因组
生成 BAM
标记 duplicate
碱基质量值重算/校正
变异检测
数据库过滤
注释
关键位点 Sanger 验证

工具最少要配对到这一步：

比对：BWA
变异检测：Mutect2 / VarScan
注释：ANNOVAR

5. `Panel / WES / WGS` 区别¶

这个也很高频，必须会比较。

Panel：只测预设少量位点，成本低，但范围最小
WES：测全部外显子，兼顾成本、深度和致病变异信息
WGS：测全基因组，范围最大，但相同预算下重点位点深度更难保证

一句话记忆：

Panel 最窄
WES 最实用
WGS 最全但最贵、最吃深度

6. 单细胞 `10x` 的 `barcode` 和 `UMI`¶

这两个概念必须背熟。

barcode：凝胶珠/细胞的身份证
UMI：分子的身份证
polyT：和 mRNA 的 poly(A) 尾结合

老师要求到的程度：

看到题目能解释各自作用
能说明为什么单细胞需要 barcode + UMI

四、要理解到会做题¶

这些内容不一定要逐页背诵，但要理解到能做判断题、简答题、应用题。

1. 为什么 `RNA-seq` 要先比对再计数¶

FASTQ 只是短序列片段，不知道属于哪个基因
只有先比对到参考基因组，才能知道来源位置
然后才能统计各基因上的 read counts
有了表达矩阵，才能做差异分析

2. 为什么 `RNA-seq` 和 `DNA-seq` 对 duplicate 的处理不同¶

DNA-seq 中完全相同起止位置的 reads 常常提示 PCR 重复
RNA-seq 中高表达基因本来就可能产生很多相同位置的转录本
所以不能简单照搬 DNA-seq 的去重逻辑

3. 为什么 `WES` 这么常用¶

外显子只占基因组 1%~2%
但富集了大量致病变异
在控制成本的同时，更容易把重点区域测得更深

4. 为什么 `WES` 结果不能直接完全相信¶

测序本身有误差
比对有误差
变异调用有误差
所以要做数据库过滤和注释
关键结果最好再做 Sanger 验证

5. 为什么单细胞技术有意义¶

可以看细胞异质性
可以做细胞分群、亚群特征、标志物筛选
在肿瘤、发育、免疫等研究里尤其重要

五、会认工具和用途即可¶

这部分一般不要求把命令行和安装步骤背下来，但工具名字要会和环节对应。

1. 质控相关¶

FastQC
MultiQC
Trim_galore

要求：

知道它们用于测序数据质控
不要求背命令

2. 比对与比对后文件¶

BWA
Bowtie
SAM/BAM
Qualimap

要求：

知道 BWA/Bowtie 是比对工具
知道 BAM 是比对结果文件
知道 Qualimap 可看覆盖深度等比对质量

3. `RNA-seq` 分析¶

featureCounts
HTSeq
DESeq2
edgeR

要求：

至少能说出它们分别用于计数还是差异分析

4. `WES` 分析¶

GATK
Mutect2
VarScan
ANNOVAR
MutSig

要求：

GATK/Mutect2：找突变
ANNOVAR：注释突变
MutSig：更偏驱动基因分析

5. 单细胞分析¶

Seurat

要求：

知道是单细胞分析常用工具包
不要求背所有参数和完整代码

六、可以略放松，不必死背细节¶

这些内容看懂即可，不值得花太多时间死背。

Sanger 每一步实验容器操作细节
Illumina 建库的每一轮化学细节
PacBio 和 Nanopore 的物理检测细节
flowcell / lane / tile 的特别细结构描述
GATK 下载、环境变量配置、参考文件下载步骤
各个软件的官网安装页面和命令细节

七、按部分总结掌握程度¶

1. 测序平台原理部分¶

Sanger、Illumina、PacBio、Nanopore
要求：知道大致原理和优缺点，不要求背全部实验细节

2. 二代测序基础术语部分¶

read、R1/R2、FASTQ、参考基因组、BAM
要求：必须熟，后面流程题默认你全懂

3. `RNA-seq` 部分¶

要求：必须达到“能画流程图、能口述步骤、能说工具名”的程度

4. 单细胞部分¶

10x、barcode、UMI、Seurat
要求：核心概念要背，分析大框架要懂，平台细节不必全背

5. `Panel/WES/WGS` 部分¶

要求：必须会比较，容易出选择题、判断题、应用题

6. `WES` 部分¶

要求：必须达到“能描述标准分析框架、知道每步常用工具”的程度

八、最小背诵清单¶

如果时间紧，至少先把下面这些背下来：

FASTQ、read、R1/R2 是什么
RNA-seq 标准流程
BWA/Bowtie、featureCounts/HTSeq、DESeq2/edgeR 各自干什么
barcode 和 UMI 的区别
Panel / WES / WGS 的区别
为什么 WES 常用
WES 标准流程
Mark Duplicate 的作用
Mutect2 / VarScan / ANNOVAR 各自干什么
为什么关键突变还要 Sanger 验证

九、最像考试题的部分¶

“请描述 RNA-seq 的分析流程”
“请描述 WES 的分析流程”
“说明 WES 和 RNA-seq 在分析思路上的异同”
“解释 barcode 和 UMI 的作用”
“比较 Panel、WES、WGS”
“说明为什么要标记 duplicate、为什么还要注释和验证突变”

十、一句话结论¶

这份课件最重要的不是平台历史，而是：
测序基础术语
RNA-seq 流程
WES 流程
单细胞 barcode/UMI
Panel/WES/WGS 区别
工具名和步骤的对应关系
其中 RNA-seq 和 WES 是这章、也是期末复习中的绝对核心。